Tutaj nie znajdziecie powielających się i stresujących informacji. Prezentuję tylko ciekawe naukowe zagadnienia pozwalające Wam na spokojniejsze podejście do tematu pandemii COVID-19. Dziś chciałabym opowiedzieć Wam o trzech różnych metodach, dzięki którym diagności laboratoryjni są w stanie określić, czy jesteście zarażeni wirusem SARS-CoV-2.
W poprzednim poście pisałam o tym czym jest ten wirus i jak atakuje nasz układ oddechowy.
Zastanówcie się – tak na zdrowy chłopski rozum: czego szukalibyście w swoim organizmie, aby potwierdzić w nim obecność wirusa?
Na dzień dzisiejszy szuka się jednego z trzech dowodów. Dwa pochodzą od naszego nieproszonego gościa, są to fragmenty materiału genetycznego wirusa (RNA) lub białka otoczki wirusa. Można też szukać materiału wytworzonego przez nas samych: konkretnych przeciwciał przeciwko SARS-CoV-2. O ile pierwsze dwa można znaleźć tuż po zarażeniu, do tych ostatnich potrzeba trochę czasu, aby nasz układ immunologiczny zadziałał.
Dobrze Sherlocku! Teraz potrzebujemy trzech różnych metod do wykrycia każdego z podejrzanych.
1. Detekcja materiału genetycznego metodą RT-PCR:
PCR (Polymerase Chain Reaction) to metoda, którą każdy laborant chociaż raz w życiu zrobił. Jest to sposób na zwiększenie ilości materiału genetycznego. Czy pamiętacie filmy, gdzie detektyw z bardzo małej próbki np. włosa lub fragmentu naskórka jest w stanie udowodnić kto jest zabójcą? W takich sytuacjach przydaje się PCR. Cykliczna zmiana temperatury oraz odpowiednio dobrane primery i enzymy pozwalają na produkcję praktycznie nieograniczonej ilości kopii fragmentu DNA. Teraz wyobraźcie sobie, że otrzymujecie próbkę śliny pacjenta podejrzanego o zachorowanie na COVID-19. Co robicie? Izolujecie z tej próbki RNA (chorzy oprócz swojego RNA będą mieli też materiał genetyczny wirusa) i techniką RT-PCR (Reverse Transcription-PCR) za pomocą enzymu transkrybujecie RNA do cDNA (bardziej stabilny nośnik tego samego materiału genetycznego). Potem sprawdzacie, czy do któregoś fragmentu cDNA w próbce przyczepią się specjalnie zaprojektowane primery (krótkie nici DNA) z fragmentami komplementarnymi do sekwencji wirusa. Jeśli jeśli tak się stanie, polimeraza będzie kontynuowała dalszą produkcję komplementarnej nici. Powstanie z tego chwilowa podwójna helisa, do której przyczepi się barwnik produkujący sygnał zapisywany w czasie rzeczywistym. Cały proces powtarza się około 30 razy, ilość materiału genetycznego rośnie eksponencjonalnie, co pozwala nam na zdiagnozowanie pozytywnych przypadków patrząc na ekran monitora. Cały proces trwa kilka godzin.
2. Detekcja białek otoczki wirusa:
Najlepszą metodą na wykrycie obecności jakichkolwiek białek jest tzw. Western Blot, nazwany od pana o nazwisku Southern, który wymyślił Southern blot (wykrywający DNA, nie białka). Istnieją też Nothern bloty (wykrywające RNA). W każdym razie dzisiaj chodzi nam tylko Westerna nazywanego w labie w skrócie WB. Eksperyment polega na umieszczeniu próbki z krwi lub śliny pacjenta w żelu polyakrylamidowym. Ten żel nie dość że denaturuje białka (sekwencja aminokwasów zostaje ta sama, ale białko traci swoją aktywność oraz charakterystyczną strukturę) to okrywa je wszystkie negatywnym ładunkiem. Żel umieszczony jest pomiędzy minusową, a dodatnią elektrodą, przez które płynie prąd. To powoduje, że małe białka szybko wędrują od minusa do plusa, a te większe nie są takie sprytne i robią to dużo wolniej. W efekcie otrzymujemy linię która przypomina drabinę od największej do najmniejszej proteiny. Teraz następuje sławny blot – transfer białek z żelu na membranę. Po co? Bo tylko na membranę zadziałają podane przez nas później przeciwciała przeciwko białkom wirusa, na żelu niestety byłoby to niemożliwe. Aplikujemy dwa rodzaje przeciwciał, najpierw te przeciwko białkom, które szukamy, a potem drugie przeciwciała przeciwko pierwszym przeciwciałom, oznakowane fluorescencyjnym barwnikiem. Barwnik pozwala zobrazować białko wirusa na naszej membrance. Jeśli oczywiście ono tam istnieje! Cały proces może trwać ponad 24 godziny. Interpretacja wyników jest prosta – kreska na wysokości rozmiaru białka wirusa to wynik pozytywny, a jej brak to wynik negatywny!
3. Detekcja przeciwciał przeciwko wirusowi:
Tym razem bierzemy próbkę od pacjenta i sprawdzamy, czy wytworzył on przeciwciała przeciwko SARS-Cov-2, co jest jednoznaczne z przebytą infekcją. Nie jest to test, którym wykryje się aktualne zarażenie, ale można nim sprawdzić wynik dodatni z innych metod (aby uniknąć tzw. “fałszywych pozytywów”). Na czym to polega? Używa się do tego specjalnych talerzyków z wieloma dołkami (96 albo nawet 384!) pokrytymi antygenami (fragmentami konkretnego wirusa). Do każdego dołka dodajemy próbkę innego pacjenta i jeśli wytworzył on przeciwciała, to przyczepią się one do antygenu. Każdy dołek jest potem wypłukany z tego co się nie przyczepiło, a na te umiejscowione przeciwciała nakłada się drugie przeciwciała (jak w WB), po to aby je wykryć za pomocą barwnika. Drugie przeciwciała przyklejają się do pierwszych i wytwarzają sygnał zmieniając kolor dołka. Dzięki temu dołki ze zmienionym kolorem są uznane za wynik pozytywny. Cały proces trwa około 2 godzin.
Laboratoria na całym świecie używają powyższych technik do wykrywania wszelkiego rodzaju wirusów. Tymczasem w Polsce możemy się pochwalić nowościami w kierunku diagnostyki koronawirusa! Otóż polska grupa badawcza z Uniwersytetu Jagiellońskiego opracowuje test do użycia poza laboratorium – udało im się wyizolować białka charakterystyczne dla wirusa SARS-Cov-2, a teraz szukają molekuł, które będą z nimi szybko reagować. Te molekuły będą umieszczone na specjalnych elektrodach wskazujących wynik dodatni jako impuls elektryczny. Trzymamy kciuki za ich dalsze osiągnięcia! Lubelska firma farmaceutyczna również zabłysła w świecie farmacji, ponieważ opracowała szybką metodę wykrywania przeciwciał – zapewne na zasadzie testu ELISA. Brawa dla polskich naukowców!
motivelina.com 
Jedna myśl